大菱鲆幼鱼对不同蛋白源营养感知与应答机制的初步研究

【摘要】本研究以我国北方重要海水经济养殖鱼类大菱鲆（ScophthalmusmaximusL.）为实验对象，在室内长流水养殖系统中进行摄食生长实验，研究不同动植物蛋白源替代鱼粉蛋白对大菱鲆幼鱼生长性能、饲料利用及生理生化指标的影响。并在此基础上探讨鱼类对植物蛋白源耐受性差的分子机制。1、不同动植物蛋白源部分替代饲料鱼粉蛋白对大菱鲆幼鱼生长特性、血浆生化指标及组织游离氨基酸含量的影响本实验以初始体重（9.19±0.01g）的大菱鲆幼鱼为研究对象，通过30天的摄食生长实验，旨在比较研究不同动植物蛋白源替代饲料鱼粉对大菱鲆幼鱼生长，体组成，血浆生化指标及血浆和肌肉游离氨基酸含量的影响。共设计六组等氮等能的实验饲料，以鱼粉组（FM）作为对照组，分别以豆粕（SB）、玉米蛋白粉（CG）、肉骨粉（MB）以及三种蛋白源等蛋白混合物（Mix）替代FM组45%鱼粉蛋白设计四个替代组；另外，以FM组饲料氨基酸组成为标准，在豆粕替代45%鱼粉蛋白后补充必需氨基酸（EAA）至对照组水平，设计添加限制性氨基酸组（SB+AA）。每个处理3个重复，每个重复40尾鱼，每天2次饱食投喂。研究表明，与FM组比，四个替代组均显著降低大菱鲆幼鱼特定生长率、摄食量、蛋白质和脂肪滞留率（P＜0.05），且均以CG组最低，其它三组组间差异不显著；SB+AA组以上各指标较SB组有一定程度提高，但差异不显著（P＞0.05）。除Mix组外，另四个实验组均较FM组全鱼粗脂肪含量显著降低（P＜0.05）。各替代组血浆葡萄糖（GLU）、甘油三酯（TG）和总胆固醇（TCHO）含量均不同程度低于FM组。非鱼粉蛋白源替代鱼粉后均显著降低血浆某几种游离必需氨基酸含量，且与蛋白源限制性氨基酸种类相关；而添加限制性氨基酸后可大大改善血浆FAA含量及平衡性。除CG和MB组血浆游离TEAA和TAA显著低于FM组（P＜0.05）外，其它各组与FM组差异不显著。肌肉游离EAA降低幅度和不平衡性大于血浆，表现为五替代组的TEAA、TNEAA和TAA均显著低于对照组（P＜0.05），以CG组最低。SB+AA组较SB组可一定程度改善肌肉游离必需氨基酸含量，但与SB组差异不显著（P＞0.05），但是添加包膜Met使其含量显著高于FM组（P＜0.05）。以上实验结果表明三种蛋白源单独或复合替代45%鱼粉蛋白均显著抑制生长，降低饲料效率，影响鱼体营养物质的组成及代谢状况，降低组织游离氨基酸平衡性和总量。另外，当替代组饲料中添加限制性氨基酸可一定程度改善豆粕蛋白源氨基酸的不平衡。2、豆粕部分替代饲料鱼粉蛋白对大菱鲆幼鱼组织游离氨基酸含量，及小肽和氨基酸转运载体基因表达动态变化的影响选择生长实验中的FM组、SB组和SB+AA组三个处理组为本章三个不同处理，旨在研究豆粕替代鱼粉蛋白，对大菱鲆幼鱼摄食后血浆和肌肉组织游离氨基酸动态变化，氨基酸分解代谢关键酶基因表达，以及肠和肌肉小肽和氨基酸转运载体mRNA表达量动态变化的影响。各饲料饱食投喂大菱鲆幼鱼30天，禁食48h后重新投喂相应饲料，分别在0h（禁食）、2h、8h和24h取样。以后各章实验条件及样品采集同本章。结果表明，摄食促进肠对氨基酸的吸收，血浆各游离必需氨基酸（EAA）含量在2h或8h达最大值（P＜0.01），肌肉各游离EAA含量在8h或24h达最大值（P＜0.01）。不同处理组间同一氨基酸存在峰值时间不一致的现象，如血浆中Thr和His，肌肉中Thr、Val、Ile等。与FM组比，SB组不同程度降低血浆和肌肉的单一和总游离EAA的含量，且肌肉各游离EAA的降低幅度和不平衡性更大（P＜0.05）；而SB+AA组血浆FAA含量与FM组差异不显著（P＞0.05），但SB+AA组肌肉FAA稍高于SB组，显著低于FM组。摄食SB组饲料较FM组肠和肌肉支链氨基酸分解关键酶BCKD-E2表达量均显著升高。摄食后，肠PepT1在2h显著升高，各处理组间差异不显著。摄食显著降低肠氨基酸转运载体B0AT1，SNAT2、TAT1、PAT1、b0,+AT和CAT2的基因表达，提高ASCT2、LAT2和y+LAT1的表达量（P＜0.05）；肌肉中，摄食降低LAT2和CAT2的表达量，而提高其它氨基酸转运载体的表达丰度（P＜0.05）。豆粕替代鱼粉显著提高肠B0AT1的表达（P＜0.05），以及肌肉B0AT1、SNAT2、LAT2、TAT1、PAT1和y+LAT1的表达量（P＜0.01）；添加限制性氨基酸可一定程度降低氨基酸转运载体表达量，其中肌肉SB+AA组的LAT2、TAT1和PAT1与FM组差异不显著。以上实验表明，豆粕与鱼粉的氨基酸存在吸收动力学差异，豆粕替代饲料中的鱼粉蛋白降低大菱鲆血浆和肌肉中FAA含量及平衡性，从而加剧肌肉中EAA的氧化消耗；另外，饲料中添加的限制性氨基酸吸收速度较饲料中结合态氨基酸快，存在不同步现象，因此不能被有效利用。肠和肌肉中的氨基酸转运载体在摄食后动态学变化不同，说明受不同机制调控。当大菱鲆幼鱼摄食添加豆粕的饲料后上调了主要氨基酸转运载体的表达量，说明在氨基酸受限的情况下，鱼体通过上调载体量促进氨基酸的吸收。3、豆粕部分替代饲料鱼粉蛋白对大菱鲆幼鱼营养感知AAR和TOR信号通路的影响选择生长实验中的FM组、SB组和SB+AA组三个处理组为本章三个不同处理，旨在研究豆粕替代鱼粉蛋白，对大菱鲆幼鱼两条重要的生长调节信号通路：氨基酸应答信号通路（AAR）和雷帕霉素靶蛋白信号通路（TOR）的影响。研究表明，摄食抑制AAR信号通路，表现为摄食后肠、肌肉和肝脏中P-eIF2α和ATF4总蛋白表达量均大大降低。肠和肌肉中ATF4mRNA表达量在摄食后均有升高，转录因子ATF4依赖的ATF3、ASNS和CHOP表达量在摄食后显著升高（P＜0.05），而REDD1和4E-BP1表达量在摄食后显著降低（P＜0.05）。与FM组相比，豆粕替代鱼粉后极大提高P-eIF2α和ATF4总蛋白表达量；SB组显著提高肠ASNS、CHOP、REDD1和4E-BP1表达量（P＜0.05）；极显著提高肌肉GCN2mRNA表达量及转录因子ATF4依赖的基因转录（P＜0.01），而SB+AA组基因表达量介于其它二组之间。摄食激活TOR信号通路，表现为摄食提高信号通路上游Akt、TOR本身及下游S6和4E-BP1的磷酸化水平，均在2h快速升高，8h后快速降低。与鱼粉组相比，SB组和SB+AA组均抑制了肌肉和肝脏中四种信号传导蛋白的磷酸化水平。肌肉和肝脏中Akt、TOR和S6的总蛋白表达量不受摄食时间和摄食饲料种类的影响（P＞0.05），而4E-BP1总蛋白表达量受摄食和饲料影响（P＜0.05）。以上实验表明，鱼体内，随摄食后机体循环库营养因子水平升高，AAR信号通路被抑制，而TOR信号通路被激活。与FM组相比，豆粕替代鱼粉后激活了AAR信号通路，而大大抑制了TOR信号通路活性。添加限制性氨基酸可以一定程度抑制AAR信号通路活性，而对TOR信号通路作用不大。摄食植物蛋白源饲料后两条通路共同抑制体内总体蛋白质的合成，且两条通路相互调节，使动物在不利条件下存活。4、豆粕部分替代饲料鱼粉蛋白对大菱鲆幼鱼糖脂代谢关键酶基因表达的影响选择生长实验中的FM组、SB组和SB+AA组三个处理组为本章三个不同处理，旨在研究豆粕替代鱼粉蛋白，对大菱鲆幼鱼肝脏糖脂代谢和肌肉脂肪合成的影响。研究表明，摄食后血浆TG含量显著升高。而摄食不同饲料显著影响血浆GLU、TG、TCHO的含量，表现为FM组显著高于SB和SB+AA组。肝脏糖酵解途径关键酶基因GK和PK在摄食后显著升高，FM组GK表达量显著高于SB组和SB+AA组，FM组和SB+AA组PK表达量均显著高于SB组。肝脏糖异生途径关键酶基因FBPase和G6Pase2在摄食后显著降低，FM组二基因表达量均显著高于SB组和SB+AA组。肝脏脂肪酸合成途径关键酶基因（SREBP-1、FAS、PPARγ、G6PD），甘油三酯和胆固醇酯合成途径关键酶基因（DGAT1、DGAT2、SOAT2）表达量均在摄食后均显著升高，FM组四个基因表达量均显著高于SB和SB+AA组。且肌肉脂肪合成途径关键酶基因SREBP-1、FAS和DGAT1表达量也在摄食后显著升高，FM组三个基因表达量均显著高于SB组和SB+AA组。肝脏中脂肪酸氧化途径关键酶基因CPT1a和ACOX1表达量在摄食后显著升高，但不受摄食饲料种类影响。综上，摄食显著促进大菱鲆幼鱼肝脏糖酵解和机体脂肪合成，但抑制肝脏糖异生过程，对脂肪酸氧化的影响不显著。当大菱鲆摄食添加豆粕的饲料后，较FM组显著抑制机体脂肪合成过程，且血浆TG、TCHO变化与之一致，这也是摄食植物蛋白源导致鱼体粗脂肪含量和脂肪沉积率降低的分子机制。另外，豆粕替代鱼粉显著降低肝脏糖酵解和糖异生过程，且血糖变化与之一致，因此摄食豆粕饲料后也影响鱼体能量代谢过程。
【作者】许丹丹；
【导师】何艮；
【作者基本信息】中国海洋大学，水产养殖，2014，博士
【关键词】大菱鲆；蛋白源；豆粕；氨基酸；载体；AAR；TOR；代谢；

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